分享PIERCE超敏型發(fā)光液的使用及注意事項
瀏覽次數(shù)：1852發(fā)布日期：2022-03-26
PIERCE超敏型發(fā)光液直接或間接檢測與辣根過氧化物酶HRP關(guān)聯(lián)的蛋白或核酸底物。這一*的發(fā)光底物系統(tǒng)是目前靈敏的商業(yè)化熒光ECL檢測試劑，具有*靈敏度和高信噪比，可檢測出10-100fg的微量抗原；發(fā)光迅速，熒光可使X感光膠片感光達12小時以上，特別適用于痕量蛋白或核酸檢測。同時該試劑允許使用更高的抗體稀釋倍數(shù)，極其節(jié)省抗體。
PIERCE超敏型發(fā)光液的使用
1.常規(guī)電泳、跨膜、HRP標記抗體或核酸探針培養(yǎng)和膜清洗。應注意用HRP或夾心法標記免疫球蛋白。將核酸雜交膜與HRP標記探針雜交并清洗。
2.在清洗膜上用HRP標記第二抗體的同時，新鮮制備工作液：將相同體積的A和B分別混合，置于室溫下，恢復熒光強度，否則熒光強度會減弱。建議立即使用工作液。它在室溫下幾小時后仍可以使用，但靈敏度略有降低。
3.用鑷子把膜取出，放在濾紙上，把乳液排出，但不要使膜*干燥。將薄膜*浸入并與發(fā)光工作液(約0.125 ml發(fā)光工作液/cm2薄膜)*接觸。在室溫下孵育3分鐘后，立即將薄膜壓平并曝光。長孵育時間不會增加敏感性，有時會導致異常暴露帶。發(fā)光過程的本質(zhì)是酶促反應。發(fā)光工作液太少不利于反應，也會導致薄膜上條帶曝光不均勻，靈敏度大大降低。為了省錢，可以減少薄膜的用量，但不應減少發(fā)光液的用量。
4.用鑷子拿起薄膜，放在濾紙上，放出發(fā)光工作液。但不要把光亮沖走。
5.將面積大于膠片的保鮮膜放在X射線膠片盒內(nèi)部。混合膜貼在保鮮膜上。混合膠卷被折疊起來并*包裹起來。去除氣泡和皺紋，并可切斷邊緣多余的保鮮膜。用濾紙吸收多余的熒光工作液。將覆蓋混合膜的保鮮膜用膠帶固定在暗盒中，推薦的蛋白帶朝上。
6.把X光膠片放在黑暗中，曝光時間不同，比如幾秒到幾分鐘。沖洗顯影液。
PIERCE超敏型發(fā)光液注意事項：
1.步驟1-5可以在熒光燈下操作，但在強光照射時間過長時，發(fā)光液體的靈敏度可能會略有降低，因此可以避免移動到暗室。戴手套可以避免在膜上留下指紋，保持膜的清潔。
2..長期暴露或蛋白質(zhì)過量會加深背景，使帶強度變化失去線性關(guān)系。曝光不足會使波段變模糊。
3.膜上的帶在孵育3分鐘后會發(fā)光。暗室中肉眼可見強條帶，而低豐度蛋白條帶則較弱。雖然肉眼看不見，但它們可以曝光X光片。光波段的發(fā)光時間不能單獨用肉眼觀察來判斷。不可見熒光實際上持續(xù)數(shù)小時，使X射線膠片感光，因此弱帶可以暴露1-10小時。如果暴露后條帶不好，可使用洗滌緩沖液清洗膜，再次出現(xiàn)第二抗體，然后重新使用ECL燈和暴露。
4、由于PIERCE超敏型發(fā)光液的高靈敏度，強烈推薦大多數(shù)進口抗體起始濃度為一抗1：1000-1：4000，二抗1：2000-1：5000。抗體濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導致失敗！
5.一些商業(yè)保鮮膜封裝的壓印膜將熄滅熒光。選用優(yōu)質(zhì)保鮮膜，如“克林來”牌保鮮膜。
6.使用可見的預染色蛋白標記和熒光放射自顯影曝光標簽可以幫助確定膠片上條帶的確切位置和尺寸。
7.NaN3能抑制HRP的活性。第二種抗體回收后應避免使用NaN3。如有必要，不得超過0.01%。
